上海秉越電子儀器有限（xiàn）公司

OOS(outofspecification,超限度、超規格)結果，是指產品質量指標測試中超出已經（jīng）建立（lì）的可接受標準的單個或一係列結果。無菌產品的陽性（xìng）結果、微生物限度試驗超出行動值（zhí）或超過規格、內毒素試驗（yàn）結果超標準等均為OOS結（jié）果《中國藥典》2015年版m和新版《藥品（pǐn）生（shēng）產質量（liàng）管理規範》（GMP)增加了OOS調查章節，對（duì）微生物實驗室（shì）00S結果的調（diào）查做出了較為詳細的闡述和實例分析，要求任何OOS結果必須按（àn）照書麵規程進行完整的調查。因為隻（zhī）有確定了OOS結果產生的原因並判定（dìng）其是否有效，進而才能製訂（dìng）完善的預防和整改（gǎi）措施，以保證檢驗結果的（de）準確性。因此，實（shí）驗室建立OOS調查處理程序，對OOS結果（guǒ）進行科學、及時、有效的調（diào）查分析處理是十分必要（yào）的（de）微生物在自然環境中（zhōng）無處不在，並可能會隨檢驗人員、檢驗用器材以及檢（jiǎn）品的包裝容器進入檢驗環境。因此，關於微生物檢驗中（zhōng）藥品（pǐn）的無菌檢査項目（mù），新版藥典（diǎn）對其操（cāo）作環境（jìng）提出了更（gèng）高要求，新版GMP也加強了對無菌操作環境空氣微生物、表麵（miàn）微生物（wù）以及人員手套和操作服表（biǎo）麵微生物的監測頻率，並做出了明確規定。而對（duì）於無菌檢査OOS結（jié）果（guǒ）的調査，需核實的相關記錄和（hé）影響因素更為繁雜。基於它的複雜性，OOS結果的調查須追溯到實驗過程的每一個環節，而對於它（tā）的變異性，調查過程又需針對不同的OOS結果著重分析調查相（xiàng）應的不同環節。
對於微生物實（shí）驗室（shì）OOS的調查，局限於每個檢驗單位的技術水平和資源，同（tóng）樣（yàng）限於人類對微生物掌握的局限，不是每次的OOS調査都可（kě）以發現其根本原因，但通過此（cǐ）調査過程仍能夠幫助（zhù）調查者找出超標結果發生的可能原因並（bìng）進而采取糾正（zhèng）預防措（cuò）施（shī），基於風險分析，對相關（guān）批次產品做出最後處理決定'從而降低藥品質量風險（xiǎn），既是保證藥品質量的重要工作，又（yòu）是質量體係持續改進的原動力。本（běn）文通過對4批無菌產品的（de）無菌檢査實驗全過程（chéng）的回顧性分析和調查，探索導（dǎo）致無菌實驗OOS結果的明確原因（yīn），以（yǐ）期建立微（wēi）生物（wù）實驗室完善的OOS調査方（fāng）案。
1、材料、儀器（qì）與試（shì）劑
全自動智能無菌集菌儀(上海（hǎi）秉越zw-2008)一次性使用全（quán）封閉（bì）集菌培養器顯微鏡AxiosescopeA
全自動微生物鑒定儀
酵母菌鑒定卡
無菌檢查樣品為4個（gè）批號的注射（shè）用頭孢（bāo）噻膀鈉。
2、方（fāng）法與結果
2.1實驗方法
 
2.1.1藥品的無菌檢查
依（yī）照《中國藥典》2010年版_檢驗注射用頭孢噻（sāi）肟鈉的無菌檢查項目。
2.1.2鏡檢及鑒定
取陽性樣本，劃線TSA平（píng）板培養24~48h，按照儀器（qì）及試劑的使用說明，對經過純化的微生物進行革蘭氏染色，確定微生物形態，然（rán）後根據形態選擇鑒定（dìng）卡（kǎ），使用全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact進行鑒定。
 
2.2結果
 
4個批號的注射用頭孢（bāo）噻肟鈉的（de）無菌檢查檢驗結果如表1所示：2號和4號樣品改良馬丁培養基均在第3天變渾濁。取（qǔ）改良馬丁培養液劃線TSA平板，30~35℃培養48h，平板上呈現白色、光滑、邊緣整齊、形態單一的菌落。
革蘭氏染色鏡檢結果為酵母（mǔ）菌。經全（quán）自（zì）動微生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均為季也蒙假絲酵母。
 
3、OOS結果的（de）調查和分析
依據新版GMP對OOS調查的要求，回顧性分析調查（chá）注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查OOS結（jié）果產生的（de）原因。
 
①日常監控和驗收（shōu）記錄：
培養基的驗收記錄、培養基的製備和（hé）滅菌（jun1）記錄、檢驗器具準備和（hé）滅（miè）菌記錄（lù）、消毒液配置和無菌過濾記錄、潔淨室清潔消（xiāo）毒記錄、檢驗員（yuán）使用潔淨服的滅菌記錄和使用記錄、無菌檢驗操作記錄以（yǐ）及環（huán）境監控記錄等均未發（fā）現異常。
②人員：
甲和乙實驗人員均能熟練（liàn）掌握無菌檢驗的流程、監控要點和無菌操作（zuò）規範（fàn）。
③樣品：
確認樣品的編號和批號無誤，無菌檢査取樣前，樣品西林（lín）瓶外觀正常，西林瓶蓋並未發現鬆動（dòng）的跡象。
④實驗器具：
實驗中使用的py330集菌器、一次件使用無菌注射器以及一次性使用無（wú）菌手套的無菌驗收均符合規定，且用於當天其他檢品的檢驗，並（bìng）未發現汙染（rǎn）情況。
⑤培養基及衝洗液（yè）和稀釋液：
無菌檢查用培養基的陰性對照（zhào）均符合規定，且同批製備和滅菌的培養基用於同日檢查的其他檢品，並（bìng）未發現汙染情況。
⑥檢驗環境：
現場環境監控的3皿沉降菌監測的TSA平皿均未有（yǒu）菌落生長，並未出現汙染情況。定期環境檢測表麵菌符合規定，樣品無菌檢（jiǎn）查當日潔淨空（kōng）調係統均運行正常。
⑦不同檢驗體係對結果判定造（zào）成的影響：
由於現行《中國藥典（diǎn）》無（wú）菌檢查使用的改良馬丁培養基不同（tóng）於國際標準使用的TSB,將（jiāng）改良馬丁培養物劃線TSA平板上（shàng）長出的菌落接種至TSB培養液中in),24h後培養液即出現混濁現象。因此可（kě）以（yǐ）排除因檢驗（yàn）體係（xì）不同造成的實驗結果偏差（chà）。
⑧菌（jun1）株：
樣品檢出菌經鑒定為（wéi）季也蒙假絲酵母菌，比對曰常潔淨室監控收（shōu）集的菌（jun1）株建立的菌庫，潔淨室中（zhōng）從未監測（cè）到此種菌（jun1）株。
⑨附加實驗的結果（guǒ）與分析（xī）：
通過以上分析，初步認定無菌不合格為實（shí）驗有效結果。但鑒於此（cǐ）次無菌檢驗過程並未嚴格按照新版GMP和《中國藥典（diǎn）》2015年版規定的對（duì）檢驗（yàn）環境和人員的全麵監控，環境和（hé）人員帶來的汙染仍有造成OOS結果的可能性，附加實驗就是對（duì）檢驗環（huán）境（jìng）進行全麵監測。
現場環境監控按照新版GMP的要求實（shí）施，並增加對潔淨室回（huí）風口浮遊菌的（de）監測，監測結果均符合規定。微生物監測方麵，除實驗人員無菌服胸口處采集到（dào）一個菌落，其他均未有菌（jun1）落生長。實驗人員無菌服（fú）采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經鑒（jiàn）定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種曾在日常潔淨室監（jiān）控中不止一次檢出過，並未對樣品產生過汙染。
4、結論與討論
OOS結果表明，並未在實驗室發現導致OOS結果的明確原因，檢（jiǎn）出菌也並非由於實驗室（shì）檢驗過（guò）程（chéng）帶來的汙染，懷疑樣品本身被季也蒙（méng）假絲酵母菌所汙染，從而導致（zhì）無菌檢查的陽（yáng）性結果。
通過對上述OOS的調查和分析，初步建立了微生物實驗室OOS結果調查的分析方案，分別從人、機、料、法、環5個（gè）方麵進行闡述：
人——實（shí）驗人員。考察（chá）人員是否經過相關檢驗的培訓和考核，是否了（le）解該項檢驗的流程和監控要點（diǎn）。無菌區全體人員每年應進行一次再（zài）培訓和資（zī）格的（de）再確認，對（duì）無菌區人（rén）員操作服和（hé）手套表麵的微生物（wù）監測嚴格按新版GMP執行（háng）；
機——實（shí）驗中使用的儀器設（shè）備。檢查集菌儀等儀器近期使用記錄是否發現異常，參數設置是否正確。儀器的計量和校準均需在有效期內，無菌區內使用的儀器需定期消毒（dú）並定期進行微生物的表麵監測，使用的器具需經滅菌消（xiāo）毒，一次性使用器具需經質量驗收；
料——樣（yàng）品、培（péi）養基、稀釋（shì）液和衝洗液。檢（jiǎn）查剩餘樣品的編號和批號是否準確，樣品的外觀是否（fǒu）異常，瓶蓋是否有鬆脫現象以及樣品的前期存放條件和（hé）取樣方式是否（fǒu）合理。必要時，對樣品的瓶蓋和瓶口等關鍵部位擦抹取樣，培養（yǎng）觀察；
檢查培養基質量驗收記錄和配製記錄，確認配製和滅菌是否合理有效，是否用於其他樣品的檢驗，培養基、稀釋液和衝洗液的陰性對照應符合規（guī）定；
法——檢驗方法和依據。實驗所用標準應符合設定實驗（yàn）和檢驗依據的要（yào）求；
環——實驗環境。檢查潔淨空調係統是否運行正常，監測記（jì）錄包括定期監控（kòng）記（jì）錄和實驗（yàn）現場環境監（jiān）控記錄，是否符合潔淨度要求，清（qīng）潔（jié）記錄顯示是否按時清潔，消毒液是否使用合理。另外，未確定OOS結果（guǒ）產生的明確原因時，不能急於對環境進行消毒處理，以免忽略了可能的（de）環境汙染因素。
 
微（wēi）生物負荷和實驗檢出菌的比對（duì）分析。實驗室的微生（shēng）物負荷，包括潔淨室的空氣微生物、表麵微生物和人員（yuán）操作服及手套的表麵微生物。對日常環境監控收集的菌株進行有效（xiào）鑒別（bié）和分（fèn）析，建立潔淨室生物負載數據庫，可為微生物OOS調査提供數據基礎。
 
對檢出菌進行鑒定，分析監控收集的微生物分布和鑒定與陽性結果的相關（guān）性，當發現與陽性菌株相（xiàng）近的菌株時，可利用分子生物學方法比對陽性菌株與微生物負荷的同源性，為陽性菌（jun1）的汙染溯源提供依據。
此外，對不同實驗會產生不同的（de）OOS結果，可針（zhēn）對某些相（xiàng）關環節靈活考察。例如，針對（duì）不同的微生物，采用不同的監測手（shǒu）段，陽性檢出菌為酵母菌（jun1）時，增加沙氏葡（pú）萄糖瓊脂用於（yú）環境監控（kòng）的附加實（shí）驗，則能夠更好地確認環境中的該類微生（shēng）物。
需要著（zhe）重強調的是，檢出（chū）菌的鑒別對於OOS結果的調查非常關鍵，決定最後是否可以發現根本原因，應該給予足夠重（chóng）視。
綜上所述，微（wēi）生物相（xiàng）關檢驗項（xiàng）目（mù）OOS結果的調查工作量很大，且（qiě）專業性強，實驗室（shì）不僅（jǐn）需（xū）要具備受過良好培訓和具有豐富（fù）檢驗經驗的工作人員，還（hái）需建立完善的OOS調查方案來規範調查操作（zuò）。